在液相色譜分析中，二元高壓梯度系統憑借其高精度、高重現性的優勢，已成為復雜樣品分離分析的首要選擇技術。梯度程序的正確設定與優化，直接決定了分離效果、分析效率和結果的可靠性。本文將系統闡述二元高壓梯度系統梯度程序的設定方法、關鍵參數調整策略以及常見問題的解決方案，為分析工作者提供一套完整的操作指南。
 

　　一、梯度程序設定的基礎準備

　　1.系統配置確認是設定梯度程序的第一步。二元高壓梯度系統由兩臺高壓泵、在線混合器、色譜柱和檢測器組成。在開始設定前，需確認：

　　①兩臺泵分別連接正確的流動相；

　　②管路連接無泄漏，溶劑已充分脫氣；

　　③色譜柱類型與流動相兼容；

　　④系統已完成排氣和平衡操作。這些基礎準備工作是確保梯度程序準確執行的前提。

　　2.軟件界面熟悉至關重要。不同品牌儀器的工作站軟件界面略有差異，但核心功能模塊相似。通常包括：泵參數設置、梯度程序表、檢測器參數、柱溫箱設置等。建議初次使用者先通過軟件模擬功能預覽梯度曲線，確認設置無誤后再執行實際運行。

　　二、梯度程序的核心參數設定方法

　　1.初始條件設定

　　初始條件決定了梯度洗脫的起點。在二元系統中，流動相A和B的初始比例總和必須為100%。例如，若采用乙腈-水體系，初始比例可設為A泵（水）95%、B泵（乙腈）5%。初始比例的選擇需考慮樣品中最早洗脫組分的保留特性——若初始有機相比例過高，可能導致弱保留組分過早洗脫，分離度不足；若過低，則可能延長分析時間。一般建議根據預實驗結果或文獻方法確定初始比例，對于未知樣品可從低有機相比例（如5%）開始探索。

　　2.梯度時間與斜率設置

　　梯度時間（tG）指從初始比例變化到終止比例所需的時間，直接影響分離效率和峰容量。梯度斜率（即單位時間內有機相比例的變化率）的計算公式為：斜率=(B終-B初)/tG。例如，從5%乙腈到95%乙腈，梯度時間20分鐘，則斜率為4.5%/min。

　　設定原則：

　　①對于組分極性差異大的復雜樣品，應采用較長的梯度時間（如30-60分鐘）和緩和的斜率，以提高分離度；

　　②對于簡單樣品或高通量分析，可采用短梯度時間（5-10分鐘）和陡峭斜率，縮短分析周期；

　　③若目標組分集中在某一時間段出峰，可采用分段梯度——在關鍵區域放緩斜率，其他區域快速變化，實現"局部優化"。實際設定時，可在工作站軟件中直接輸入時間點對應的B泵濃度，系統會自動計算斜率。

　　3.終止條件與平衡時間

　　梯度程序結束時，通常需要設置一段"保持時間"，使流動相比例穩定在終止比例，確保所有組分全部洗脫。隨后，系統應自動切換回初始比例，并保持足夠時間進行柱平衡，為下一次進樣做準備。若平衡不充分，會導致保留時間漂移、峰形變差。現代工作站軟件通常提供"自動平衡"功能，可根據系統延遲體積自動計算所需平衡時間。

　　4.流速與壓力參數

　　二元高壓梯度系統的總流速由兩臺泵的流速之和決定。流速設置需考慮色譜柱規格和系統耐壓上限。對于常規分析柱，流速通常設為1.0mL/min；對于UPLC系統或小內徑柱，流速相應降低。壓力上限應設置為色譜柱和系統允許的最大壓力的80%左右，以保護色譜柱和泵系統。梯度洗脫過程中，由于流動相組成變化，系統壓力會隨之波動，這是正常現象，但需監控壓力曲線是否平穩，避免劇烈波動。

　　三、梯度程序的優化調整策略

　　1.基于分離效果的參數調整

　　當初始梯度程序運行后，若出現以下問題，需針對性調整：

　　①分離度不足：若目標峰與相鄰雜質峰未全部分離，可嘗試：延長梯度時間，降低斜率、在目標峰出峰區域設置"平臺"，增加該區域的分離時間、調整初始或終止比例，改變目標峰的保留位置，避開干擾峰。

　　②峰形拖尾或前伸：可能是流動相pH或緩沖鹽濃度不匹配，需優化流動相添加劑，而非單純調整梯度程序。

　　③保留時間漂移：檢查柱溫是否穩定、流動相是否充分平衡、系統延遲體積是否準確校準。若為系統性問題，需重新平衡色譜柱或檢查泵的混合精度。

　　2.梯度曲線類型的靈活運用

　　除線性梯度外，二元高壓梯度系統還支持多種曲線類型，可根據分離需求選擇：

　　①凸形梯度：起始變化快，后期變化慢，適用于早期組分分離度差、后期組分易分離的樣品。

　　②凹形梯度：起始變化慢，后期變化快，適用于早期組分易分離、后期組分難分離的樣品。

　　③階梯梯度：在特定時間點直接切換比例，適用于組分極性差異極大的樣品，但可能引起基線波動。

　　大多數工作站軟件提供"梯度曲線編輯器"，可通過拖拽曲線上的控制點來調整梯度形狀，實現更精細的優化。

　　3.系統延遲體積的校正

　　系統延遲體積會影響梯度程序的"實際執行時間"。若未校正，會導致保留時間滯后。校正方法：

　　①查閱儀器說明書獲取標準延遲體積值；

　　②通過實驗測定——運行一個從0%到100%的快速梯度，記錄檢測器響應時間與程序設定時間的差值，計算實際延遲體積。現代儀器通常內置自動校正功能，在軟件中輸入實際延遲體積后，系統會自動補償，確保梯度程序準確執行。

　　四、常見問題與解決方案

　　1.基線漂移或波動：梯度洗脫中，若兩種流動相的紫外吸收差異較大，易導致基線漂移。解決方案：

　　①使用高純度溶劑，減少雜質干擾；

　　②在檢測器前增加參比池，進行基線扣除；

　　③若漂移嚴重，可考慮使用緩沖鹽或添加劑平衡紫外吸收，或改用其他檢測波長。

　　2.壓力異常波動：梯度過程中壓力劇烈波動可能原因：

　　①流動相混合不均勻，產生氣泡；

　　②泵密封圈磨損；

　　③混合器堵塞。需檢查溶劑脫氣是否充分、泵頭是否漏液、混合器是否需清洗。

　　3.重現性差：若多次運行同一梯度程序，保留時間或峰面積差異大，需檢查：

　　①流動相配制是否準確（建議使用稱量法而非體積法）；

　　②柱溫是否穩定；

　　③泵的混合精度是否達標（可通過運行空白梯度驗證）；

　　④色譜柱是否老化或污染。

　　結語

　　二元高壓梯度系統的梯度程序設定是一項理論與實踐相結合的技術。掌握基礎參數設置方法、理解梯度曲線對分離的影響、學會基于色譜圖反饋進行針對性優化，是提升分析質量的關鍵。建議初學者從簡單線性梯度開始，逐步嘗試分段梯度、曲線梯度等復雜程序，通過實際樣品反復驗證，積累經驗。隨著對樣品性質、色譜柱特性和儀器性能的深入理解，梯度程序的設定將更加得心應手，最終實現高效、精準的分離分析目標。